Bevezetés

A tumorok genetikai hátterű betegségek, a jelenlegi ismereteink szerint a dagana- tos megbetegedéseket a genomot érintő speciális, a tumorkialakulásban szerepet játszó eltérések (mutációk) okozzák. Ezen genetikai eltéréseket, köszönhetően a molekuláris genetika területén az elmúlt időszakban tapasztalható jelentős fejlődésnek, egyre kiterjedtebben ismerjük, ezen tudást az orvostudomány a napi klinikai gyakorlatban is felhasználja.

A legtöbb tumor esetében ismert, hogy legkülönbözőbb, a tumorral kapcsolatos biológiai anyagok kerülnek a véráramba mind korai, mind későbbi tumorstádium esetében. Ezek az anyagok lehetnek a véráramban keringő tumorsejtek, tumorból felszabadult DNS, exoszómák, microRNS-ek, illetve különböző szubcelluláris komponensek (mint például tumorral összefüggésbe hozott vírusok nukleinsavai), különböző fehérjék és glükoproteinek is. Ezek közül a keringő tumorsejtek vagy a keringő tumor-DNS véráramból történő vizsgálatát folyadékbiopsziának nevezzük (NIH, é. n.).

A folyadékbiopszia tehát nem több, mint különböző molekuláris biológiai technológiák kombinálása a vérben vagy egyéb testfolyadékok- ban keringő biomarkerek azonosítására, azonban elmondhatjuk, hogy megvan benne a lehetőség, hogy gyökeresen megújítsa az egészségügyet. A vérből való vizsgálat előnye a sebészeti úton elérhető tumormintával szemben, hogy elvileg korlátlanul elérhető és naprakész mintából dolgozik, így a kapott genetikai eredmény az adott pillanatot mutatja, és nem hetekkel vagy hónapokkal korábbi állapotot, amikor a vizsgált tumor esetleg még eltérő genetikai profilt mutatott.

Öszszefoglalónkban – elsősorban a keringő tumor-DNS-re fókuszálva – bemutatjuk azt az utat, amelyen a folyadékbiopsziához eljutottunk, megvizsgáljuk előnyeit és korlátait. Mindezek mellett foglalkozunk a legújabb molekuláris genetikai eszköztár (NGS és ddPCR) klinikai alkalmazhatóságával elsősorban az onkológia területén, kiemelve a folyadékbiopszia szerepét a korai felismerés, a prognózis, a terápiás döntés támogatása és a terápiára adódó válasz előrejelzése területén.

KERINGŐ DNS A VÉRPLAZMÁBAN FIZIOLÓGIÁS ÉS PATOLÓGIÁS ÁLLAPOTOKBAN

Érdekes módon, a vérkeringésben leírt tumor-DNS leírása néhány évvel megelőzte a szakirodalomban a keringő DNS-ek várandósság alatti szűréssel kapcsolatos felhasználását (Stroun et al., 1989; Lo, 1997). Ennek ellenére mégis a különböző, elsősorban a 13-as, 18-as és 21-es kromoszómák számbeli eltéréseinek szűrésére használt, a várandós véréből elvégezhető, ún. nem invazív prenatális tesztek (NIPT) voltak az elsők, amelyek megbízható, nagy specificitású és szenzitivitású tesztekké váltak. Elmondhatjuk, hogy NIPT-teszteket napjainkban a terhességek egyre növekvő arányában használnak fel rutinszerűen. Ezzel szemben a tumoros páciensek számára tervezett folyadékbiopszia eljárások fejlesztése eleinte komoly akadályokba ütközött. Nézzük, ez miért lehetett így!

Az első, sejtmentes, DNS-alapú tumorazonosítás várandósban a véletlen műve volt, 2013-ban. C. Michael Osborne és munkatársai (2013) egy 37 éves hölgyet írtak le, akinek a NIPT eredménye a 13-as és a 18-as kromoszómák eltérő számát mutatta (amelyek megfelelnek az Edwards- és Patau-szindrómáknak együttesen), ám a megszületett fiúcsecsemő semmiféle ilyen kromoszóma-rendellenességet nem mutatott. A nő későbbi vizsgálatai viszont kissejtes tumort mutattak ki a hüvelyi szövetmintában, amelyekben érdekes módon a NIPT által kimutatott kromoszóma-rendellenességek voltak kimutathatóak – így ezt tekintjük az első, ctDNS-alapú tumorkimutatásnak.

A terhesség egy nagyon jól ismert, nagyon jól reprodukálható fiziológiás esemény, amely esetében az anya vérében a magzatból származó keringő DNS aránya a 9. terhességi héttől rendszeresen eléri vagy meghaladja a 10%-ot is. Valójában úgy néz ki, hogy a jelenlegi NIPT-technológiák 3-4%-os magzati DNS-koncentráció alatt jellemzően nem is adnak ki eredményt, mivel ebben az alacsony, keringő DNS-tartományban fals negatív eredményeket is eredményezhetnek. Ezzel szemben a tumoros állapot egy erősen heterogén, nagyon változatos patológiás esemény, amely mindamellett, hogy dinamikusan változó betegség, jelentős számú – és változó – genetikai eltéréssel és komplex betegséglefolyással bír. Maga a tumor is változik, és a keringésbe bocsátott DNS mennyisége és minősége is széles határokon belül ingadozhat. Ennek következtében a gyakran 4% alatti koncentrációjú tumormutáns DNS-fragmensek száma is jelentősen változhat még az azonos tumorstádiumú betegek körében is. Ezért a keringő tumor-DNS- (circulating tumour DNS, ctDNS) analízist sokkal nehezebb standardizálni, különösen a korai betegségszakaszok kimutatására, amelyre a folyadékbiopszát alkalmazni szeretnénk (Heitzer et al., 2017).

GENETIKAI ELTÉRÉSEK TUMOROKBAN

A tumor egy komplex patológiás állapot, amelynek több mint száz különböző formáját ismerjük, mindegyikhez változatos kockázatokkal és epidemiológiai adatokkal. Tumoros elfajulás kialakulhat gyakorlatilag a szervezet bármely sejt- vagy szövettípusából. Viszonylag féktelen sejtosztódás jellemzi, amely során az osztódó tumorsejtek be tudnak hatolni a környező szövetekbe, és emellett távoli áttéteket is képezhetnek. Ami egyértelműen megkülönbözteti a tumorsejtet az egészséges sejtektől, az a genomjában létrejövő elváltozások, genetikai mutációk. Ezek az elváltozások többfélék lehetnek, úgy mint egypontos nukleotid variációk (SNV) az adott génen belül vagy a szabályzó régióiban, kromoszóma szerkezetbeli változások, DNS-metiláció-változások és kópiaszám-változások (CVN). Ezeket a sokféle genetikai eltéréseket nagy nemzetközi adatbázisok rendszerezik – mint például az International Cancer Genome Consortium (ICGC) és a The Genomic Atlas of Cancer (TCGA) – azért, hogy a különböző rákok hátterét, kialakulását, rizikófaktorait vagy kezelését minél jobban megismerhessük.

Az újgenerációs szekvenálási (NGS) módszerek megjelenésével, amelyek lehetővé tették nagymennyiségű genetikai információ párhuzamos kinyerését a különböző tumormintákból, lehetővé vált a legkülönbözőbb tumorok mintáinak karakterizálása. Így leírhattuk az egyes tumorokban gyakrabban (esetenként kizárólagosan) előforduló mutációkat, lehetővé téve nemcsak az adott tumorok diagnózisát, hanem a célzott daganatterápiát is. Ez utóbbinál, tehát a célzott vagy más néven személyre szabott tumorterápia esetében, minden egyes tumort az adott tumorban előforduló genetikai mutáció (mintázat) alapján kezelünk, így előfordulhat, hogy morfológiailag két azonos vastagbéltumort eltérően kell kezelnünk, mivel az elváltozások mögött eltérő DNS-mutációk, így eltérő biológiai mechanizmusok állhatnak.

FOLYADÉKBIOPSZIA TUMOROK ESETÉBEN

A már említett, kiragadott példák mellett sok esetben olyan helyen levő tumorok vizsgálata is lehetővé válik folyadékbiopsziával, amely tumorokból az elhelyezkedésükből kifolyólag nehéz szövettani mintához jutni (mint például az agyban lévő daganat vagy hasnyálmigyrák esetében). A sebészi minták továbbra is kiemelten fontosak lesznek a tumodiagnosztikában vagy a kezelés irányának és módjának eldöntésében, azonban beláthatjuk, hogy a sebészi mintáknak vannak limitációik is. Felismertük, hogy a tumorok nem statikusak, hanem dinamikusan változó genetikai képet mutató patológiás szövetek, amelyek egy adott pillanatbani vizsgálata eltérő képet mutat egy korábbi vagy későbbi időhöz képest (ezt nevezzük tumorevolúciónak). A tumorok genetikai mintázata időről időre változik spontán módon is, illetve például adott célzott daganatterápiára válaszul is. Ezeknek a változásoknak a követésére kimondottan alkalmas a folyadékbiopszia, mivel nem egy historikus adatot nyújt (például egy sebészileg eltávolított vagy szövetmintavétel során kivett tumordarabból), hanem további invazív mintavétel nélkül is mindig az adott pillanatban a keringésbe kerülő tumor-DNS-ek vizsgálatát teszi lehetővé.

Jelenleg három nagy területen várható eredmény a folyadékbiopszia technológiától (NIH, é. n.): a tumorok detektálása (Stroun et al., 1989), kimenetelének prognózisa, illetőleg a tumorellenes kezelésekre való érzékenység megállapítása (Lo, 1997). És bár a sebészi minták genetikai vizsgálata nem szűnik meg, úgy gondoljuk, hogy a következő néhány éven belül a folyadékbiopsziás eljárások – kiegészítve a jelenlegi technológiákat – gyorsan fejlődnek, és el is terjednek a korai detektálás és terápia monitorozása érdekében. Tudományos bizonyítékok sora támasztja alá, hogy a hasnyálmirigy-, ovárium-, hólyag-, vastagbél-, melanoma és emlőrákok 75%-ában kimutathatóak keringő tumor-DNS-ek, míg a fej-nyaki- vagy pajzsmirigyrákok esetében is ez az érték több mint 50%. Ezek a számok azt mutatják, hogy reális ennek a módszernek a közeljövőben történő rutinszerű elterjedése.

A folyadékbiopszia korai diagnosztikára történő alkalmazhatóságát megelőzte a vezető laboratóriumok által már ma is elérhetővé tett vizsgálatcsoport a tumorterápia monitorozására (amely szorosan összefügg a terápia személyre szabhatóságával). Kimutatták, hogy tüdőrákok (elsősorban a nem kissejtes változat, az NSCLC) esetében a terápia során rendszeres időközönként elvégzett folyadékbiopsziás meghatározások pontos képet adnak az alkalmazott tirozin-kináz-gátló (TKI) típusú célzott gyógyszerekre való rezisztencia kialakulásáról. A jelenleg használt TKI-k esetében a páciensek akár felében is kialakulhat egy olyan mutáció az EGFR-génben (ún. T790M), amely hatására a tumor érzéketlen lesz az alkalmazott gyógyszerre. Ehhez az információhoz eddig csak sorozatos tüdőbiopsziákkal juthattunk hozzá, amely mindamellett, hogy invazív beavatkozás, sok esetben egyszerűen a tumor mérete, elhelyezkedése, illetve a páciens állapota miatt kivitelezhetetlen. Az ESMO (European Society for Medical Oncology) így hivatalosan az ajánlásába vette a folyadékbiopsziát az ismételt klasszikus biopszia alternatívájaként EGFR-mutációval rendelkező páciensek esetében. További vizsgálatok jelentős egyezést mutattak ki más tumorok esetében is. Vastagbéltumorban a sebészi szövetminta és a folyadékbiopszia eredménye között szignifikáns korreláció mutatható ki, így várhatóan a vastagbéltumorokban is hamarosan megjelennek a hivatalos ajánlások a keringő tumor-DNS vizsgálatára.

EGYÉB FOLYADÉKBIOPSZIÁS BIOMARKEREK

Írásunk elején megemlítettük, hogy a vérben vagy egyéb testfolyadékokban különböző fajtájú tumor-biomarkereknek is alkalmas vegyületek vagy formációk vannak. Ilyenek például maguk a keringő tumorsejtek, amelyek szintén megjelennek a vérben. Kimutatták, hogy alacsony számú, 1–10 darab tumorsejt található 1 ml vérben különféle, már áttéteket képzett tumorok esetében. De ilyen markerek lehetnek különböző kisebb sejtdarabok, mint az exoszómák, a kis gömb alakú vezikulák, amelyeknek különféle DNS-, RNS- vagy fehérjetartalma lehet specifikus az adott betegségre. Napjainkban jelentős és eredményes erőfeszítések történnek az exoszómák klinikai diagnosztikába való beemelésére. Nem mehetünk el a különféle RNS- (elsősorban miRNS) molekulák biomarkerként történő alkalmazása vagy a tumorból kiszabaduló, mutációt hordozó mitokondriális DNS felhasználása mellett sem, ám jelenleg úgy tűnik, hogy a legsűrűbben felhasznált vagy leginkább a rutinszerű napi felhasználást elérő, vérben keringő biomarker a keringő DNS.

PREANALITIKA ÉS VIZSGÁLATI ELJÁRÁSOK CTDNS-EK KIMUTATÁSÁRA

Mielőtt magukra a laboratóriumi diagnosztikai eljárásokra térnénk, meg kell említeni, hogy a folyadékbiopsziára történő mintavételezés meglehetősen speciális mintavételi eljárás. Mivel a vérben szabadon keringő DNS-eket szeretnénk kimutatni, meg kell akadályozni, hogy a mintavétel során az érintetlen sejtek – jellemzően fehérvérsejtek – „kipukkadjanak”, így belekerüljön a plazmába a saját DNS-ük, elfedve az eredetileg ott levő szabad-DNS-mintázatot. A piacon még alig néhány gyártótól érhetőek el, és meglehetősen drágán olyan speciális vérvételi csövek, amelyekben ez a folyamat minimalizálható az alatt az idő alatt, ameddig a minta eljut a meghatározásig. Ügyelni kell a megfelelő és óvatos mintavételre is, illetve magának a már levett vérmintának a szállítására a sejtek összetöredeződésének minimalizálása érdekében.

A laboratóriumi vizsgálatokat a teljesség igénye nélkül csoportosíthatjuk aszerint, hogy milyen típusú eltéréseket szeretnénk kimutatni (Domínguez-Vigil, 2018) (1. táblázat).

Módszer	Technológia	Érzékenység	Vizsgálni kívánt eltérés
qPCR (mennyiségi PCR)	ARMS-Scorpions PCR Clamping PCR TaqMan	0,05–0,1% 0,1–1% 0,1–1%	Ismert egy vagy néhány mutáció
Digitális PCR	Beaming ddPCR	0,01% 0,001%	Ismert egy vagy néhány mutáció
Célzott szekvenálás	Amplikon NGS SAFE-SeqS CAPP-Seq	>1% 0,1% 0,01%	Mutációk a vizsgált génszakaszokban
Teljes genom vizsgálat (WGA)	Digitális kariotipizálás (aCGH) PARE	0,001% 0,001%	Genombeli kópiaszám-változás Genom-átrendeződés

ÖSSZEFOGLALÁS

A folyadékbiopszia folyamatosan bővülő elérhetővé válása várhatóan jelentős mértékben kiegészítheti, megváltoztathatja a jelenlegi tumordiagnosztikai és kezelési stratégiákat, a sebészi mintavételezés alternatívájaként. A folyadékbiopsziával közel valós idejű tumorgenetikai információhoz juthatunk, amelynek segítségével megvalósítható a korai észlelés és pontosabbá tehető a betegség prognózisa. A terápiára való reagálás felmérése és az esetleges rezisztencia kialakulása is gyorsabban és kevésbé invazívan válhat vizsgálhatóvá. További vizsgálatokra van szükség, hogy megfelelően alátámasztott tudományos és klinikai adatok birtokában mielőbb széleskörűen bevezethessük ezt a forradalmian új módszert a napi klinikumba.

Magyar megnevezés	Angol megnevezés
keringő tumorsejtek	circulating tumour cells – CTC
tumorból felszabadult DNS (ctDNS), keringő tumor-DNS	circulating tumour DNA – ctDNA
exoszómák	exosomes
microRNS (miRNS)	microRNA (miRNA)
újgenerációs szekvenálás (NGS)	next-generation sequencing (NGS)
digitális droplet PCR (ddPCR)	digital droplet PCR (ddPCR)
nem invazív prenatális tesztelés (NIPT)	non-invasive prenatal testing (NIPT)

IRODALOM

Domínguez-Vigil, I. G. et al. (2018): The Dawn of the Liquid Biopsy in the Fight Against Cancer, Oncotarget, Jan 5; 9, 2,: 2912–2922. DOI: 10.18632/oncotarget, http://www.oncotarget.com/ index.php?journal=oncotarget&page=article&op=view&path[]=23131&pubmed-linkout=1

Heitzer, E. – Perakis, S. – Geigl, Jochen B. – Speicher, M. R. (2017): The Potential of Liquid Biopsies for the Early Detection of Cancer. Nature Partner Journals Precision Oncology, Vol. 1, Article number: 36. DOI: 10.1038/s41698-017-0039-5, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ articles/PMC5871864/

Lo, Y. M. et al. (1997): Presence of Fetal DNA in Maternal Plasma and Serum. The Lancet, 350, 485–487. DOI: 10.1016/S0140-6736(97)02174-0

NIH – National Cancer Institute, US (é. n.): Definition of Liquid Biopsy – NCI Dictionary of Cancer Terms. National Cancer Institute, https://www.cancer.gov/publications/dictionaries/ cancer-terms/def/liquid-biopsy

Osborne, C. M. – Hardisty, E. – Devers, P. (2013): Discordant Noninvasive Prenatal Testing Results in a Patient Subsequently Diagnosed with Metastatic Disease. Prenat Diagn., 33, 609–611. DOI: 10.1002/pd.4100, https://obgyn.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/pd.4100

Stroun, M. et al. (1989): Neoplastic Characteristics of the DNA Found in the Plasma of Cancer Patients. Oncology, 46, 318–322. DOI: 10.1159/000226740